Thiết kế đoạn dẫn RNA cho CRISPR/cas9

Phần 1: Cách thiết kế sgRNA
Tìm được sgRNA có hiệu quả gây mất chức năng gen là bước dường như quan trọng nhất trong cả quy trình phức tạp của KO gen. Vì nếu thiết kế sg không tốt (hoặc có thể tạm gọi là không may mắn cho vui) thì sau cả một chuỗi ngày làm việc vất vả, bao nhiêu công sức và tiền của hoá chất đổ vào, nhưng sau đó chạy wb thì protein của cái gen đó vẫn trơ trơ, gene đó vẫn hoạt động bình thường thì sao có thể nghiên cứu vai trò của gene đó trong tế bào theo mục đích xoá gen được phải không nào.

Do đó, thông thường hầu hết các nhà nghiên cứu sẽ chọn ít nhất là 5 sgRNA cho 1 gen mục tiêu, với mình thì thường chọn 10 sgRNA cho 1 gen, đây là 1 ví dụ cho mọi người quan sát nhé, bài báo đã được đăng vài tháng trước đây, nếu bạn nào quan tâm thì nhắn tin cho mình mình gửi full bài báo cho các bạn chứ cái báo này bắt các bạn phải mua mới đọc được.

Hình 1: sgCTRL là những sgRNA cũng chứa 20 RNA nhưng không target vào bất cứ gen nào trong hệ thống gen của người.

gRHEB.1 đến sgRHEB.10 là 10sg mà mình đã chọn từ hệ thống thư viện có sẵn. những sg này đã được chọn lọc bằng bioiformatic và các phần mềm máy tính thông minh có sẵn.

Hình 1: cho chúng ta thấy cả 4 sg cho control đều hoàn toàn không làm mất band của protein RHEB, chứng tỏ gen quy định tính trạng cho protein RHEB hoàn toàn bình thường không ảnh hưởng gì đến cấu trúc và chức năng của gen RHEB cả. (RHEB band khoảng 20 Kda)

Trong khi đó 10sgRHEB thì có đến 9 sg làm mất band của RHEB, chỉ duy nhất sg4 là band của RHEB vẫn còn nguyên, chứng tỏ là sg4 nằm trên đoạn exon không quan trọng, sau khi KO gen thì hoàn toàn không làm mất chức năng của gen RHEB.

Mình chọn 3 sg trong 9 sg có hiệu quả đã chỉ ra trong ảnh 1 để tiếp tục làm các thí nghiệm tiếp theo trên rất nhiều các dòng tế bào ung thư khác nhau để nghiên cứu vai trò của gen RHEB: sg5, sg6, sg9 : ảnh 2

Hình 3: tìm hiểu cơ chế của RHEB trên mô hình KO gen RHEB

Sau khi KO gen RHEB, dòng tế bào KO gây biến đổi rõ rệt các cơ chế liên quan tới S6K, 4E-BP (cơ chế sinh ung thư) được chỉ ra trong thí nghiệm wb. Actin là protein control cho thí nghiệm KO gen RHEB.

Các công cụ để thiết kế sg cho các gen mục tiêu
Trang web tổng quát chung.

https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR/Cas_tools
https://zlab.bio/guide-design-resources
Trang mình hay sử dụng để thiết kế sgRNA

https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool
http://chopchop.cbu.uib.no
https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/genome-editing/gene...
Ngày khác mình sẽ hướng dẫn cách thiết kế sgRNA bằng tay. Có vẻ sẽ hiểu dễ hơn và sâu hơn so với trường hợp mọi thứ đều vất lên máy và các phần mềm cho tự chạy như thế này nhỉ.

Còn cách đơn giản nhất là mình đã có cả 1 thư viện sgRNA cho 18.166 genes cho bộ gen người, tìm và take out. Đơn giản và hiệu quả nhất lại đỡ tốn bao nhiêu nơ ron thần kinh nữa chứ.