Làm sao để tạo ra được một virus có khả năng chỉnh sửa gene bằng công nghệ CRISPR/Cas9

Chia sẻ bài viết tiếp theo về công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/cas9 nha. Ai cùng mối quan tâm thì chúng ta cùng trao đổi nha

Sau phần giới thiệu về lịch sử phát triển của hệ thống CRISPR/Cas9, hôm nay chủ đề bài viết là làm sao để tạo ra được một virus có khả năng chỉnh sửa gene bằng công nghệ CRISPR/Cas9?

Hình 1 thể hiện kết quả sau khi cắt 1 đoạn gen nhắm đích của lentiCRISPR/Cas9 trên dòng tế bào người bị ung thư. Sau khi sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 để cắt gen mục tiêu, từng tế bào được phân lập và nuôi thành dòng, tách riêng 2 chuỗi DNA để giải trình tự. Kết quả cho thấy dòng tế bào số 1 không bị cắt, đoạn gen ở vị trí đoạn dẫn hoàn toàn giống với thể tự nhiên, còn dòng tb thứ 2 là thể mà cả 2 chuỗi DNA đều bị cắt với những kết quả đột biến khác nhau, dòng tế bào số 3 chỉ có 1 chuỗi bị cắt, dòng tế bào số 4 được bắt nguồn từ 2 tế bào khác nhau ban đầu nên kết quả giải trình tự cho thấy trên 3 dòng đột biến: 1 chuỗi mất 1 Nucleotide (nu), 1 chuỗi mất 4 nu và đột biến điểm thay thế C bằng A, một chuỗi mất 4 nu và có đột biến điểm thay thế G bằng T. Vậy bằng cách nào chúng ta có thể làm được điều này, mình sẽ trình bày ngắn gọn sơ lược cơ chế và quy trình cho các bạn cùng hiểu qua nhé.

Các nhóm CRISPR/Cas có nhiều phân lớp enzyme cas khác nhau (xem bảng 1) mình chỉ tập trung nghiên cứu và dùng nhiều trên cas9. Các cas khác có nhiều nhược điểm khác nhau và hiện nay đang được nghiên cứu thêm để cải thiện khả năng của chúng.

I. Ví dụ thực tế bằng hình ảnh của quy trình CRISPR/Cas9

Nói thì ngắn vậy thôi chứ nếu mình bắt tay vào làm thì với tốc độ nhanh nhất kiểu như nonstop thì cũng mất ít nhất 7 ngày đến 10 ngày mới có thể taọ được loại virus có thể sửa chữa gen theo cơ chế của CRISPR/Cas9. Các bước để tạo ra một virus có khả năng sửa chữa gene như sau:

1. Chọn plasmid vector, cắt và tinh sạch vector bằng enzyme cắt đặc hiệu dành riêng cho vector mà bạn dùng. Cấu trúc vector cơ bản được miêu tả như hình số 2. Lúc này ta đã có vector bị cắt tại ví trí đặc hiệu và có thể gắn những đoạn cDNA (bạn tạo ra cDNA từ oligo RNA mong muốn hay còn gọi là RNA dẫn đường (guide RNA). Vị trí cắt enzyme rất quan trọng cho việc đặt oligo, để sau đó cDNA có thể được gắn ngược trở lại vào vị trí đã cắt của vector. Chính vì vậy mà với những người làm nhiều họ có thể nhìn trình tự của oligo mà nhận ra loại plasmid nào chuẩn bị được dùng.

(Note: Mình thường sử dụng plasmid có gắn sẵn các đặc điểm mà mình mong muốn để sau này mình có thể xác định được các tế bào nào đã được nhiễm virus và các tế bào nào chưa nhiễm, vì thực tế khi virus xâm nhập vào quần thể tế bào thì phụ thuộc rất lớn vào nồng độ của virus mà bạn tạo ra, hiệu suất phản ứng và còn tuỳ thuộc cả vào hoá chất, quy trình. Do đó để kiểm soát được kết quả của thí nghiệm thì mình thường chọn plasmid có gắn sẵn màu như GFP, RFP… hoặc gắn sẵn gen kháng kháng sinh như puromycin hay neomycin…, nhờ những đặc điểm này sau khi nhiễm virus mình có thể tạo được những dòng mà đảm bảo 90%-100% tế bào đã nhiễm virus, tức là đã hoàn toàn bị cắt mất gen mục tiêu.)

2. Đặt gRNA: cái này bạn đặt từ các hãng, thực ra nó chỉ là các trình tự Nucleotide dài khoảng 20-30 nucleotide, thường rất nhanh, chỉ mất 1 ngày là bộ gRNA đến tay bạn. nhưng để đặt được chuẩn gRNA bạn cần nắm được điểm đặc biệt của các plamid, enzyme cắt, và trình tự gen mà bạn muốn cắt, vì gen thường rất dài nhưng chỉ có 1 số đoạn có ý nghĩa và thực sự quan trọng cho gen đó, khi vị trí đó bị đột biến mất hay thay thế nucleotide sẽ làm cho mất chức năng của gen đó. vd mình hay chọn vùng promoter hoặc các exon từ 1 đến 10. Và thường để xoá 1 gen mình thường làm với 10 sgRNAs vì bạn không thể đảm bảo bạn chọn 2 sg là cả 2 vị trí đó là khi sửa chữa gen sẽ làm mất vai trò của cái gen đó hay không.

(cái này hơi khó hiểu chút phải không? Tức là dù bạn đã thành công cắt mất đoạn gen đó ra khỏi gen của tb nhưng nếu đoạn gen đó không quan trọng cho vai trò gen đó thì gen đó vẫn hoạt động bình thường, vẫn phiên mã dịch mã và tạo ra protein bình thường. Giống như là có đột biến gây ung thư mà có đột biến không ảnh hưởng gì đến cơ thể vậy. Vì vâỵ chọn được sg để sau khi cắt làm hoàn toàn mất tác dụng của gen cũng cần có kinh nghiệm hoặc bạn tìm trên các bài báo có thể họ sẽ cho bạn thông tin các trình tự họ đã thành công.)

3. Nối cDNA vào plasmid: dùng ligation mix reagent để nối sgRNAs (forward and reverse) vào plasmid. Lúc đó plasmid sẽ tự đóng vòng lại.

4. Transformation

Chuyển plasmid vào trong vi khuẩn ví dụ như E.Coli. mình hay dùng DH5a

Sau đó cấy vk vào đĩa thạch. Sau 12h bạn sẽ có những VK mọc lên, trong VK có plasmid mà bạn muốn

5. Nuôi VK để tăng lượng plasmid: lấy 1 khuẩn lạc không to quá không nhỏ quá, không mọc chụm lại với các khuẩn lạc khác để tăng khả năng bắt được khuẩn lạc có plasmid chứa gen đích. (Đoạn này giống như đi chọn bạn đời vậy, chọn không tốt là ăn đủ rồi đó ha ha) rồi nuôi trong LB solution để VK tăng sinh.

6. Tách và tinh sạch plamid: bằng kit thôi. nhanh chóng và hiệu quả cao

7. Tạo Virus: hình tham khảo số 3

Bạn có plasmid bạn tạo ra làm lõi, bạn cần vỏ của VR, bạn có thể dùng các plasmid khác như VSVG, hoặc PAX2 làm vỏ.

Dùng các tb có khả năng sản sinh virus để virus được hình thành và nhân lên trong chính các tế bào đó. Có cả một hệ thống các dòng tb để giúp hình thành và tăng virus lên, bạn có thể chọn rất nhiều nhưng phổ biến nhất vẫn là HEK293T cell

8. Thu virus và nhiễm vào tế bào cần cắt gen: hình tham khảo số 3

9. Kiểm tra tế bào xem hiệu suất nhiễm virus bao nhiêu, đã cắt hoàn toàn gen, kiểm tra xem gen đó đã thực sự bị mất hiệu quả sau khi đã hoàn toàn cắt gen đó đi chưa bằng western blot. Cơ chế cắt được miêu tả sơ lược ngắn gọn qua hình số 4

10. Tiến hành nghiên cứu trên dòng tb đã bị biến đổi gen quan tâm. Đây mới là phần thú vị nhất trong nghiên cứu đó, hẹn mọi người kì sau. Chúc các bạn làm nghiên cứu, làm xét nghiệm luôn đủ sức khoẻ, bản lĩnh, quyết tâm, kiên trì, minh mẫn để thành công.